摘要
CAR-T细胞疗法彻底改变了难治性，复发性恶性血液病的治疗方法。靶向B细胞表面抗原CD19的CAR-T疗法使得B细胞非霍奇金淋巴瘤和急性淋巴细胞淋巴瘤患者得到了持续性缓解。尽管CAR-T疗法取得了长足的进步，但肿瘤细胞仍然存在着多种逃逸机制躲避CAR-T的杀伤，这其中最主要的就是靶抗原的丢失，在这里，我们重点阐述迄今为止靶向CD19CAR-T细胞疗法所取得的成果，介绍单靶向治疗的局限性，阐述肿瘤逃逸机制，最终讨论多靶向性策略解决肿瘤逃逸问题。
引言
基因修饰的自体T细胞过继疗法在难治性，复发性恶性血液病方面取得了长足的进步。T细胞可以通过基因工程化表达新的T细胞受体（TCR）,或者表达嵌合抗体原受体（CAR）靶向肿瘤相关抗原。CAR修饰的T细胞包含一个抗体可变区单链（scFV）来靶向肿瘤表面抗原，融合表达一个跨膜结构域，一个胞内共刺激信号结构域，胞内共刺激结构域通常由CD28或4-1BB和CD3ζ组成。尽管临床研究表明有众多肿瘤表面抗原可用于CAR-T细胞治疗，然而目前只有针对B细胞表面CD19的CAR-T治疗在临床治疗中取得了更加喜人的成绩。CD19是一个分子量95KDa的糖蛋白，常表达于B细胞表面，贯穿于B细胞早期分化一直到浆细胞阶段。CD19作为第一个理想的CAR-T靶标，因为它主要表达于B淋巴细胞表面，未曾发现表达于其它造血干细胞表面以及绝大多数正常组织表面。靶向CD19的CAR-T细胞在复发性，难治性B细胞淋巴瘤治疗方面都有显著疗效。众多治疗相关报道显示靶向CD19的CAR-T细胞具有治疗非霍奇金淋巴瘤的潜能。从鲜有报道到临床数据爆炸性增长，如今，源源不断的临床数据从多个治疗研究中心相继传来。尽管这些研究表明CAR-T治疗取得了空前的疗效，但是靶向CD19的CAR-T治疗并不是所向披靡。部分患者仍旧对其没有反应，甚至有人治疗前期有效，后期产生了耐受。最初把这一耐受性机制归因于肿瘤细胞表面CD19表达量的下调。
迄今为止，三项研究报道了在B细胞非霍奇金淋巴瘤和急性淋巴细胞淋巴瘤取得了有效进展。首先在在B细胞非霍奇金淋巴瘤治疗方面，Neelapuet al等人报道了ZUMA-1（CD28CD3ζCAR-19-T）在复发性，难治性B细胞淋巴瘤二期临床数据，通过对108位患者治疗后一年的追踪调查发现，42%的患者有持续效果。在一组复发性且数据有效的患者中，CD19阴性被视为导致治疗失败的可能机制。Juliet研究小组评估了41BBCD3ζ CAR-19-T的疗效，二期临床试验中，在对93位患者治疗后三个月的追踪调查显示完全缓解率为32%。41BBCD3ζCAR-19-T疗法同时也在复发性，难治性儿童和年轻患者进行了试验，治疗后三个月的追踪调查显示，完全缓解率分别达到了81%和59%。得到缓解的病人仍然健在，病情未复发已达12个月。那些复发病人中，绝大多数（15/22）为CD19阴性患者，这也是目前FDA已批准的CAR-T疗法的主要局限。尽管一些临床研究表明，替代靶点CD22有很好的治疗前景，对于CD19阴性复发患者来说，已批准的疗法选择面很小，且预后一般都很差。本文主要聚焦由于靶向抗原的丢失，造成CAR-T治疗失败的机制，提出新的CAR构造策略来应对当前CAR-T治疗的困惑。
抗原丢失是CAR-T治疗恶性B细胞瘤的主要局限
尽管与传统疗法相比，早期CAR-T疗法在复发性，难治性B细胞瘤方面有显著的疗效，然而，也有不少患者对CAR-T疗法失效，部分患者CAR-T治疗初期有反应后期复发。已知的逃逸机制中，最明确的复发病因学归咎于抗原丢失。最新的临床数据显示CD19CAR-T细胞治疗B-ALL,7%-33%初期应答患者，后期复发归因于细胞表面抗原CD19的丢失，这一结果支持了Schreiber及其同事在2002年提出的免疫编辑假说。CD19丢失最早发现于CAR-T治疗的B-ALL患者过程中，患者治疗早期完全缓解，2个月后复发。在患者未感到身体不适的情况下，深度测序显示，事实上血液中已有了CD19阴性恶性细胞克隆，23天后发现于骨髓中。
随着对抗原丢失造成的CAR-T治疗局限的认识，许多研究表明存在多种机制影响抗原丢失（如图1）。Sotillo等揭示，在儿童B细胞瘤治疗中，伴随着CAR-19-T的治疗，出现了CD19获得性突变和CD19等位基因的选择性剪切，这一结果导致了细胞表面未表达CD19和表达CD19突变体的恶性细胞不再受CAR-T细胞的识别和杀伤。Fischer等人的一项研究表明，CD19的一个变体形式缺少CAR-T识别的表位，这也预示了这些患者治疗的失败。当然，以上这些结果也遭受到了不同学者的质疑，在一项最新的研究结果中，一组12人B-ALL患者抗原丢失归因于多种杂合突变丢失，鲜有选择性剪切缺失。Bagashev等人在内质网发现了保留的突变，错误折叠的CD19，这也预示着可能存在另一种抗原丢失的机制。
图1.逃避CAR-T杀伤的机制
(A)肿瘤细胞通过基因突变（I）完全丧失CD19受体表达或者（II）转变为CD19CAR不能识别或者结合的结构。（B）肿瘤细胞发生谱系转变，转变为CD19阴性。（C）慢病毒飘移导致的肿瘤细胞表面表达CAR,造成CAR-T细胞无法识别肿瘤细胞。
CAR-T细胞治疗后抗原丢失的另一个机制是细胞谱系的转变。2015年，Evans和他的同事第一次报道了谱系转变，一位CLL患者CAR-T治疗后复发发生了Richter转换，这一患者浆细胞天生就是CD19阴性。紧接着另一报道也发现了类似谱系转化，7位CD19阴性的急性髓性白血病患者中的2位在接受了CAR-T治疗后转变为混合谱系重排B-ALL。最近有报道称有TCF3-ZNF384融合阳性B-ALL儿童患者在治疗后发生了髓系转换。最新的研究报道，Ruella等人提出了CD19新的免疫逃逸机制。一例CD19阴性患者在CAR-T治疗后复发转换为单细胞CD19阳性白血病，而造成这一结果的原因正是由于CAR-T治疗过程中使用的慢病毒飘移，造成白血病细胞表面表达CD19CAR且CD19CAR顺式结合与白血病细胞表面的CD19,使得CD19CAR-T细胞无法识别这些白血病细胞。尽管这种现象鲜有所见，但是它不失为一种耐受机制，这就要求在CAR-T设计生产过程中执行严格的标准来确保免疫治疗的安全。
部分抗原丢失归因于抗原表达下调，和抗原表达完全丧失一样，也是CAR-T治疗耐受的一种机制。在应用CAR20治疗过程中，Murata和他的同事报道了发生溶细胞作用和刺激释放细胞因子所需要细胞表面抗原分子表达量的临界值，其中溶细胞作用至少要求细胞表面有200个表面抗原分子，而刺激细胞因子释放至少要多达2000个分子以上。另一项研究表明，CD30CAR靶向白血病细胞而不破坏造血干细胞的原因是表面抗原差异性的表达水平。造血干细胞表面低水平的CD30不足以引起溶细胞作用，而白血病细胞表面CD30的高表达能有效的被CD30CAR识别，起到相应的治疗效果。Mackal等人报道了不仅肿瘤细胞表面抗原分子的密度影响着CAR-T治疗效果，CAR-T细胞表面CAR分子的表达量同样影响着CAR-T的治疗效果。最新的研究报道显示，CD22CAR-T治疗后复发的患者显示B-ALL细胞表面同样存在着表面抗原分子表达量降低的现象。另一动物试验证实，白血病细胞表面CD22的差异化表达带来戏剧性的抗癌疗效，这些结果将不仅在CAR-T治疗恶性血液肿瘤方面有指导意义，实体瘤治疗方面有也有很高的指导意义。
B细胞白血病在CAR-T治疗后抗原现象的存在毋庸置疑，对于淋巴瘤患者抗原丢失评估而言，流式细胞术检测，相对于免疫组化评估抗原表达水平应用于评估抗原丢失方面更具挑战。Shalabi等人的研究结果表明，抗原丢失在淋巴瘤患者中扮演重要角色，CAR-T治疗后，CD19,CD22抗原相继消失。显而易见，淋巴瘤患者在经历CAR-T治疗后抗原丢失评估的复杂性需要更加全面可靠的方法来衡量其发生的频率。
多靶向解决CAR-T治疗后抗原丢失的困惑
比较容易解决CAR-T治疗后抗原丢失现象的方法是靶向多个抗原。这个可以通过一下四种方案里的一种解决。（1）分别生产2种或者更多种针对不同靶点CAR-T细胞，混合或者相继输注给患者，（2）通过双顺反子表达载体在同一细胞表面共表达两种CAR,(3)共转导：设计2种不同结构的CAR载体共转导T细胞，使其共表达识别两种不同抗原或者仅识别一种抗原的CAR-T混合细胞群。（4）串联表达两种CAR，在同一表达载体上串联表达两种CAR蛋白。以上方法在最近Majznerand Mackall综述里都有报道（如图2）。
图2.多靶向CAR-T策略
（A）单独生产2种或者多种针对不同靶点CAR-T细胞，混合或者相继输注给患者，（B）通过双顺贩子表达载体在同一细胞表面共表达两种CAR,(C)共转导：设计2种不同结构的CAR载体共转导TCAR-T混合细胞群。（D）串联表达两种CAR，在同一表达载体上串联表达两种CAR蛋白。
主张使用多个CAR来避免抗原丢失应用于胶质瘤治疗的研究是多靶标CAR-T早期应用于临床的研究之一。在此研究中，科学家设计了单独针对HER2和针对IL-13Rα2特异性的CAR,通过给患者输注HER2CAR-T和IL-13Rα2CAR-T混合细胞群，或者按次序输注的方式，来防止抗原丢失造成的治疗失败，两种方法都有效阻止了因抗原丢失造成的逃逸，都取得了较好的抗癌效果。Zah等人开发了一种CD19-CD20双CAR,并证明了该双重结构能有效阻止CD19阴性肿瘤细胞在免疫缺陷小鼠体内的自发发展。
2016年晚些时候，Gill和他的同事们应用上述3和4提到的方法，他们构建了同时靶向CD19和靶向CD123的CAR结构，通过靶向CD19,CD123的CAR-T混合群，或者共表达CD19,CD123的CAR-T细胞，在小鼠异体移植瘤模型上显示有良好的阻止抗原丢失和抗肿瘤作用。
Schneider等人报道了CD19-CD20串联表达CAR-T治疗的临床前研究，针对CD19和CD20的CAR以CD19-CD20,或者CD20-CD19串联表达的形式表达于CAR的胞外区。白血病异体移植瘤模型显示，无论是CD19-CD20CAR或者CD20-CD19CAR,其治疗效果都明显优于CD19CAR。CD19表达于Raji细胞表面，与CD19CAR-T细胞共孵育后，其表达量显著降低，但是与CD19-CD20,CD20-CD19CAR-T共孵育后CD19仍然保持高水平表达。有趣的是，与CD20CAR-T相比，串联表达CD19-CD20CAR-T细胞在经历了抗原阳性白血病细胞刺激后，其细胞因子分泌量较低，这就预示着当CD19,CD20CAR串联共表达的时候存在某种信号衰减机制。最后，在高负荷小鼠白血病模型上，CAR2019T细胞，无论与CD19,CD20单CAR-T或者CD19,CD20混合CAR-T细胞群相比，都显示出了更好的治疗效果。体外实验中，无论在CAR19的远端表达CAR20还是在近端表达，并没有明显的治疗优势，但是CAR2019却能更好的结合CD20多肽，起到更好的抗肿瘤作用。这一临床前研究已转化为临床1期实验，试验号(NCT03019055)，靶向人CD19-CD20双靶向CAR-T治疗。在经过治疗后复发的严重B细胞非霍奇金淋巴瘤患者中应用CAR20.19-T细胞治疗，早期剂量爬坡实验显示，3/6患者存在持续性的完全缓解和部分缓解。有趣的是，在进展或复发的三名患者中，所有人随后活检显示，都保留了CD19或CD20阳性，提示治疗失败的病因不是抗原丢失，而是其他机制。
类似于CD20.CD19CAR-T设计，Fry和他的同事们开发了一种CD19-CD22的CAR,体外实验显示,CAR-T细胞能有效杀伤CD19+和CD22+的人类白血病细胞，分泌IFN-γ作用于靶细胞，体内实验显示，CD19-CD22CAR-T细胞能有效清除白血病细胞，一项关于复发性，难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤以及B细胞急性淋巴细胞白血病一期临床试验正在进行，早期剂量爬坡实验结果显示7位患者中2位出现完全缓解。
如下图表1列举，由于鼓舞人心的临床前实验结果，许多串联CAR-T,联合CAR-T,以及分阶段的多CAR-T治疗方案正在临床试验，，同时也包含武装华的CAR-T,表达CD19受体，CD3和CD28信号基序，共刺激信号分子配体4-1BBL,同时携带自杀式基因安全系统，以防止出现的急性严重细胞毒性，尽管这种载体构建的CAR不能靶向多分子，但是武装华CAR-T的治疗思想是一开始剧烈的杀伤作用不给肿瘤细胞抗原表达丧失逃逸的机会。
表1.临床试验阶段的多靶向CAR-T
其它多靶向策略应对CAR-T治疗恶性血液病的困惑
一种有趣的方式来自与Vie和他同事先前工作的改进，一种表达CD16(FcγRIII))CAR-T细胞可以介导抗体依赖的细胞毒性（ADCC）,针对CD16的一代CAR结构包含CD16胞外胞内结构域。最近，CD16CAR被加上了CD3ζ和CD28或4-1BB。Caratelli等人在使用CD16CAR-T细胞治疗过程中伴随加入了一种或多种肿瘤相关抗原单克隆抗体来促进抗体依赖的细胞毒性作用。这是一个很有吸引力的方法，因为它允许多靶点刺激作用，只要每个单克隆抗体可以介导ADCC作用。两项CD16CAR-T细胞协同CD20抗体治疗恶性B细胞瘤的临床试验正在患者招募进行中(NCT02776813,NCT02315118)。
其它处在研发阶段的武装华的CAR包括分泌IL-18的CD19或MUC16CAR,它们似乎可以调节肿瘤内环境，包括恶性血液病和实体瘤，同时可以增强固有免疫反应起到抗肿瘤的作用。相同特性的CAR被修饰为共表达PD-1阻断部分和分泌IL-12。有趣的是，肿瘤部位局部阻断PD-1可以增强CAR-T抗肿瘤的效果，同时规避了PD-1阻断剂协同作用时产生的毒副作用。分泌IL-12的MUC16CAR通过清除肿瘤相关巨噬细胞，增强CART细胞增殖和细胞毒性，改变肿瘤微环境。最后，值得注意的是三价CAR的研发已有报道，这将非常有趣，当下和将来多靶点CAR-T能否解决抗原丢失问题，只有等时间能证明。
多靶点CAR-T治疗的局限
于当下治疗标准相比，多靶点CAR-T尽管存在着潜在的优势，然而，安全性，有效性，可操作性都是有待解决的问题。首先多靶点不能解决除了抗原丢失其它机制引起的耐药。最近，Fraietta等人报道了CD19CAR-T在治疗CLL患者过程中有效性和耐药性的决定性因素。他们证明了CAR-T细胞内在的转录组特征决定了CAR-T的疗效。在响应患者体内，CAR-T细胞富含记忆相关基因和IL6/STAT3信号，在未响应患者体内未见T细胞增殖和衰竭相关基因的上调。其它可能机制包括肿瘤细胞表面PD-L1参与抑制CAR-T杀伤作用。以上两种情况下，多靶向都不能解除耐药机制，其二，多靶点CAR-T细胞在患者体内的安全性和活性的研究还很少，很可能多靶点通过增加多靶向性会引起更强的细胞因子风暴，从而多靶点CAR-T治疗不可用。目前还不清楚体内的细胞毒性活动，是由于优先参与的CAR-T一个优于一个，或者多靶点CAR-T同时给药，无论不同靶点修饰的CAR-T能同时进入或者分布相同,如何评价多靶标CAR-T各自的疗效。最后，与多靶点相关的问题的另一个显著问题是成本问题。需要制备针对多靶标的CAR-T不止一次的转导，不止一次的制备过程都将是治疗成本相当昂贵。
结论
CD19CAR-T治疗已经彻底改变了B细胞恶性肿瘤的治疗方式，尽管在复发性，难治性患者身上取得了显著的疗效，然而久而久之的耐药性依然存在，CD19转阴是造成复发的主要原因。基因修饰造成的CD19表达量下调，甚至完全丢失，或者剪切成其它形式，造成CD19CAR-T细胞的无法识别时有发生，其它由于细胞谱系转变，表观修饰等造成的CD19转阴都给CD19CAR-T治疗带来了极大挑战。最新的研究报道称一历白血病患者治疗过程中发生了病毒飘移，使得白血病细胞表面也表达CD19CAR,这就使得CD19CAR-T细胞束手无策，最终患者不治身亡。无论何种机制，单靶向CD19造成的选择性压力以及由此而来的肿瘤细胞克隆逃逸CD19CAR-T细胞的杀伤，最终导致病情复发。多靶点CAR-T有可能解决抗原丢失造成的肿瘤细胞逃逸，起到更好的治疗效果。目前多项临床试验如火如荼的进行，疗效如何我们拭目以待。
原文来源：
Shah NN, Maatman T, Hari P, Johnson B.Multi Targeted CAR-T Cell Therapies for B-Cell Malignancies.Front Oncol. 2019 Mar 12;9:146.