编者按：沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis，Ctr）是一系列传染病的病原体，与子宫颈癌和卵巢癌直接或间接相关，它可以作为人乳头瘤病毒HPV感染的辅助因子，与宿主之间具有非常复杂的相互作用关系。上皮细胞间紧密相连，它们是一道严密的防线。间质细胞与上皮细胞相邻，不同的是，它们组织松散，缺乏细胞连接和细胞极性。上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition, EMT） 通俗地理解为上皮到间质细胞的转化，它赋予细胞转移和侵袭的能力。
2019年1月，来自德国马克斯普朗克感染生物学研究所的研究人员在国际专业学术期刊Cell Reports杂志上发表了一篇运用磷酸化修饰组学和转录组学揭示Ctr如何诱导宿主细胞发生上皮间质转化，从而打开免疫“防火墙”的文章。
这篇研究不仅鉴定到很多之前未知的Ctr磷酸化蛋白和受Ctr调控的宿主磷酸化蛋白，全面的展示了宿主细胞总成分及核成分中Ctr应答性激酶网络。此外还发现了包括ETS2抑制因子和原癌转录因子（TFs）在内的TFs在Ctr感染过程中发生磷酸化修饰，通过调控细胞运动与侵袭相关基因的转录诱导发生上皮间质转化，为Ctr致病过程以及其他人类生殖道感染提供新的见解。
组学思路
为了研究Ctr诱导产生的细胞信号通路，研究人员首先分别对三类样本（感染Ctr的细胞，未感染Ctr的细胞、两者的细胞混合物）的胞浆蛋白与核蛋白（样本策略）开展了磷酸化修饰WB实验。接着，在WB预实验结果的基础上，研究人员联合细胞同位素标记法（SILAC），磷酸化修饰肽段富集法及质谱检测的方法（质谱策略）对磷酸化修饰位点的差异变化进行定量研究。
研究精读
1.Ctr感染宿主的全蛋白磷酸化修饰组学研究
通过磷酸化WB实验，研究人员发现在Ctr急性感染与持续性感染的宿主细胞中磷酸化修饰水平普遍发生变化，同时质谱检测结果表明，从细胞与细胞核中共鉴定到位于4564个蛋白上的17917个特异性磷酸化位点， 有4251个蛋白上的12863个磷酸化位点具有高可信度，其中位于1252个蛋白上的2327个磷酸化位点在Ctr感染后具有显著差异变化。在总细胞提取物中，经Ctr感染后有1436个高可信度磷酸化位点的修饰表达水平显著受到调控，上调957个位点，下调479个位点。在细胞核中，1383个磷酸化位点的修饰水平在Ctr感染后发生显著改变，上调597个位点，下调786个位点。
2.Ctr诱导的激酶调控特征
Ctr调控磷酸化蛋白的通路过表达分析揭示，Ctr调控信号通路涉及广泛的分子和细胞功能。Ctr感染的总细胞提取物中的上调磷酸化蛋白显著富集的前五位信号通路，包括有小GTP酶介导的信号转导调控、细胞凋亡、应激活化蛋白激酶信号通路和JNK/MAPKKK级联。此外，总细胞提取物和细胞核中的上调磷酸化蛋白都参与基因表达和转录调控，增殖以及核苷酸代谢。而下调的磷酸化蛋白主要参与的通路与细胞骨架组构，蛋白复合体分解调控、细胞周期，染色体组织及DNA修复相关。结合IPA分析，表明生物学过程的过度显现与癌症、生殖系统、胃肠道和肝脏疾病还有和有机体损伤与异常有关。
接下来，研究人员通过从PhosphoSite-Plus database获得的位点特异性激酶-底物关系注释每个受调控的磷酸化位点的上游激酶，结果显示在2327个受调控的磷酸化位点中只有119个蛋白上的152个位点在database中具有注释信息。这一结果揭示了31个激酶包括Akt、CDK、EGFR、GSK、MAPK、RAF及Src等至少有一个或多个底物，表明Ctr调控大量激酶。
通过使用STRING数据库中的蛋白质-蛋白质相互作用信息进一步生成受Ctr调控的激酶与底物间的相互作用关系网络。该网络揭示了激酶和它们的底物之间复杂的蛋白质-蛋白质相互作用，涉及Ctr调控的不同宿主信号传导途径间的跨越。
然而，大多数Ctr调控的磷酸化位点相关上游激酶是未知的，因此，研究人员利用GPS和motif-x生物信息学工具来进行分析。GPS软件预测特定激酶或激酶家族使特定的磷酸化修饰位点发生磷酸化的可能性，motif-x软件通过分析过表达的氨基酸序列模式生成潜在的激酶底物的基序。将这些激酶底物关系定位到人类激酶组树上，发现在总细胞和核组分中调节细胞周期调控、MAPK信号传导和剪接的CMGC激酶组占比很高，如MAPK、CDK、GSK3、DYRK和HIPK，而核部分显示CAMK、AGS和TKL激酶富集。
研究人员从磷酸化蛋白质组数据中发现了81个新的Ctr蛋白被磷酸化，其主要由内含物膜蛋白组成。为了推断出起关键作用的宿主激酶，研究人员从HPRD数据库中检索到了激酶-底物关系，结果显示Ctr蛋白受PKA、PKC、CK2、GSK3、GRK、CD5和ERK1/2等激酶调节。
3. Ctr应答性转录组学和磷酸化修饰组学分析
总细胞中2倍以上差异蛋白的互作网络分析结果表明，由活化的包含有如ERF、YAP1和TNIP1等多种转录因子（TFs）的ERK1/2（MAPK1和MAPK3）调控的蛋白的主要功能模块目前在功能上与Ctr感染无明显相关性。为研究Ctr诱导的TFs磷酸化在病原体发育和宿主细胞生理上的影响，研究人员通过特异性磷酸化位点的免疫印迹实验证实了其中3个TFs（ETS1、FRA1和ERF）在End1/E6E7细胞系和hCEcto细胞系中磷酸化修饰水平的差异表达。敲低ETS1和ERF会显著降低Ctr的感染力，表明TFs在衣原体发育中的重要性。
为研究在Ctr感染中TFs在调控下游靶基因表达中所起的作用，研究者运用Ctr应答性转录组学和磷酸化修饰组学证明上皮间质转移的特征。结果显示它们参与调控多种与炎症，血管生成，上皮细胞间充质转化，肿瘤生长，细胞运动及侵袭相关的基因。与细胞运动（PLAU、PLAUR），侵袭性（SEMA7A）、炎症（IL8、TNF-α）、紧密连接（E-钙黏蛋白）和基质金属蛋白酶（MMP9）相关的基因在在急性和持续性感染的原发性人类外宫颈细胞中上调。
4. ERK调控Ctr应答FRA1、ETS1和ERF
在感染细胞中转录水平上调的EMT基因是否能够诱导EMT表型？WB结果显示持续性的Ctr感染会降低上皮标记物E-cadherin水平，而提升间充质标记物N-cadherin水平。通过Matrigel等实验发现持续性Ctr感染会增加End1/E6E7和hCEcto细胞的侵袭性。
这些数据表明Ctr诱导的ERK信号通路对控制EMT的TFs的转录和转录后调控起重要作用。Ctr感染后，ERK介导的ERF的T526位点磷酸化会导致核输出，降低抑制因子活性及促进侵袭。此外，依赖于ETS1的转录进程对Ctr诱导的EMT具有重要作用，Ctr调节ERK介导的TF调控从而诱导具有更高侵袭能力的EMT表型。
总结
本文通过磷酸化修饰组学和转录组学联合分析，揭示了Ctr诱导的宿主细胞信号通路改变的复杂性及其对细胞功能的影响。研究结果全面的展示了宿主细胞总成分及核成分中Ctr应答性激酶网络，从结果中鉴定了受调控的ERK和MAPK的底物TFs的磷酸化水平，同时证明了ETS1和ERF在EMT表型形成中的作用。本研究结果揭示了更大范围的Ctr调控的信号传导，为Ctr致病过程以及其他人类生殖道感染提供新的见解。
编者语：病原菌和宿主之间的识别从本质上讲是蛋白质之间的相互作用，基于生物质谱的蛋白质组技术，为精准医学在蛋白质水平的生命过程和生命现象提供了强有力的武器，广泛运用在感染性疾病的研究中。
参考文献：
Zadora, P. K., et al. (2019). Integrated Phosphoproteome and Transcriptome Analysis Reveals Chlamydia-Induced Epithelial-to-Mesenchymal Transition in Host Cells. Cell Reports.